回复1楼 薛传恽
Ursocholanic酸抢救线粒体功能
在家族性帕金森氏病的常见形式
1月1日Aasly2和奥利弗Bandmann1的希瑟Mortiboys
1谢菲尔德研究院转译神经科学( SITraN ) ,谢菲尔德大学,谢菲尔德,英国
2圣奥拉夫医院神经内科,挪威特隆赫姆
作者: Oliver Bandmann的医学博士
谢菲尔德研究所转化神经科学( SITraN )的,
神经科学系,
英国谢菲尔德大学,
路385A格洛索普,
英国谢菲尔德S10 2HQ
电子邮箱: o.bandmann @ sheffield.ac.uk
往前旨在以确定疾病修改的帕金森氏病的化合物的药物屏幕通常被基于
毒素诱导的体外和体内模型中,这种神经退行性疾病。所有这些化合物都没有有一个可靠的
在随后的临床试验的疾病修饰效果。我们现在已经建立了一个新的方法,即整个筛选
化合物库,直接在病人组织确定化合物对线粒体功能障碍与救援效果的一个关键
帕金森氏病的致病机制。选择MICROSOURCE化合物库包含2000个化合物,其中包括
1040持牌药物和580天然化合物。 2000化合物进行了测试,一步步为自己明智的做法
抢救的线粒体功能障碍在帕金( PARK2 )的突变体成纤维细胞的影响。 2000个化合物, 60改善线粒体
至少有两个标准差的膜电位。随后,这60种化合物,其毒性评估
类药物的剂量 - 反应。其余49种化合物进行了测试,他们对细胞内的抢救效果的辅助屏幕
ATP水平。 49种化合物, 29归ATP水平,并显示类似药物的剂量反应曲线。线粒体救援
帕金突变额外患者成纤维细胞这29种化合物15不包括在最初的效果被证实
屏幕上。的15个化合物中,两个选择其后的功能研究,即ursocholanic的酸和相关的化合物
脱氢(11,12) :乌索酸内酯。这两种化合物显着增加所有四个配合物的线粒体的活性
呼吸链。天然化合物乌索酸和持牌药物熊去氧胆酸化学密切
有关ursocholanic酸和脱氢(11,12)乌索酸内酯。所有这四种物质类似的拯救线粒体功能
帕金突变成纤维细胞的程度,暗示一类的效果。线粒体的救援效果依赖于激活的
糖皮质激素受体与Akt磷酸化增加和确认两个ursocholanic的酸和熊去氧
酸在帕金缺陷的神经元模型系统。值得注意的是,无论ursocholanic酸和熊去氧胆酸还救出线粒体
在LRRK2G2019S突变成纤维细胞的功能。我们的研究表明的可行性进行药物屏幕
帕金森氏病的病人的组织,并发现了一组化学相关化合物的显着的线粒体
抢救效果。被认为是一个时间和节约成本的战略评估已获得许可的药物不同药物重新定位
他们的神经保护作用的条件。因此,我们建议既作为一种天然化合物,熊果酸和熊去氧胆酸
酸作为未来前景的化合物在帕金森病的神经保护试验已获得许可的药物。
关键词:帕金森氏症,帕金, LRRK2 ,线粒体疾病修饰疗法
缩写: DUA =脱氢(11,12)乌索酸内酯; MPTP = 1 - 甲基-4 - 苯基-1,2,3,6 - 四氢吡啶
DOI : 10.1093/brain/awt224脑2013 :第1页,共13 | 1
2013年1月21日收到的。 2013年5月29日修订。 2013年6月9日接受。
?作者( 2013年) 。由牛津大学出版社出版代表的脑担保人。保留所有权利。
的权限,请发送电子邮件至: journals.permissions @ oup.com
2013年9月2日发表的脑高级访问
2013年9月9从http://brain.oxfordjournals.org/系列总署下载
介绍
帕金森氏症是一种常见的和无情的进步,
无法治愈的神经退行性条件。其全球范围内的发病率
预计将翻一番,到2030年(多尔西等, 2007) 。目前
可用药物只会导致症状改善
疗效有限。在过去的化合物,通常测试
推测在毒素诱导的神经保护作用,在体外和
帕金森氏病的体内模型中。然而,暴露于
毒素,如1 - 甲基 - 4 - 苯基-1,2,3,6 - 四氢吡啶
( MPTP )只有部分类似机制导致
帕金森氏病,如果在所有。随后进行的临床
试验未能证实有益的疾病修饰效果
在这些传统的任何一种很有前途的化合物与初步成效
MPTP模型(郎,2006年) 。线粒体功能障碍是一个关键
的发病机制散发性和家族
帕金森氏病( Exner小等, 2012) 。在常染色体的突变
隐性遗传帕金(也称为PARK2 )基因
可识别的原因最常见的早发性帕金森氏
疾病。的LRRK2G2019S突变是最常见的可识别
monogenically继承迟发性帕金森氏病的原因
(哈迪,2010) 。之前我们已经证实异常
线粒体功能与特定的复合物I活性降低
皮肤成纤维细胞中线粒体呼吸链的parkinmutant
患者与帕金森氏病( Mortiboys等,2008) 。
我们和其他人随后也报道了线粒体功能障碍
从患者与LRRK2G2019S突变中成纤维细胞
( Mortiboys等, 2010 ; Papkovskaia等, 2012) 。
这项研究的目的是进行体外化合物
在帕金森氏症的突变患者组织识别屏幕
线粒体救援化合物。我们的项目是基于一种假设,
的任何化合物与一个强大的线粒体救援
在帕金森氏病病人的组织的效果是更可能施加
随后的有益效果比这些化合物在临床试验中
只毒素诱导模型系统测试。二
千化合物从MICROSOURCE的光谱采集
( www.msdiscovery.com )被评定为他们的救援效果
在数个阶段的线粒体的功能。这种化合物库
由1040持牌药物,有580种天然化合物和
420其他生物活性化合物。大比例的持牌
药物和天然化合物作出合理的假设,
在我们的复合屏幕将迅速采取任何积极的命中
进入临床试验阶段。
材料与方法
患者
该项目是由当地的伦理委员会审查。通知
同意采取所有的研究参与者(见补充
表1对所有患者的进一步信息包含在这项研究中) 。
年龄四个parkinmutant之间没有显着差异
患者和他们的四个匹配的对照组(年龄在几年? SD
帕金突变的患者中,40.5 ? 6.5;控制,38.5 ? 5.5节)。同样地,
三者之间有没有显着的年龄差异
LRRK2G2019S突变的病人和他们的三个匹配的对照
( LRRK2G2019S突变的患者,59岁? 5.5;控制, 61岁? 4.5) 。
组性别相匹配的。
方法
成纤维细胞培养条件以及测量线粒体
膜电位,呼吸链功能和细胞内ATP
如前面所述进行生产( Mortiboys等人,
2008年)。
Z评分
为了评估所使用的检测的鲁棒性和再现性
作为小学和中学的屏幕,我们进行了严格的测试,使用
Z’和SW得分计算( http://www.ncats.nih 。
GOV / ) 。有关详细信息,请参阅补充材料。
主要药物筛选
第1阶段
帕金突变帕金突变的患者从两个培养成纤维细胞
的2000 MICROSOURCE频谱收集化合物
24 h后,在浓度为10mM 。每种药物进行了处理
因而,一式两份,共四个药物暴露实验
每种化合物在第一阶段进行。正命中
定义为的化合物,以改善线粒体
以上3个标准差( SD )在膜电位
至少三个的实验中,由至少2个SD在第四
的实验。积极的匹配,然后进一步在无细胞分析测试
排除假阳性可能由于自体荧光效果
药物或药物相互作用与四甲基罗丹明甲酯
( TMRM ) 。此外,测试化合物为任何细胞毒性
使用的的乳酸dehyodrogenase ( LDH )检测的影响
( Mortiboys等,2008) 。此外,剂量 - 反应
评估(0.01 ,0.03 , 0.1 , 0.3 , 1 , 3 , 10 , 30和100mM )
执行确定的剂量响应曲线的形状。
第2阶段
从第一阶段实验评估其正命中
抢救细胞内ATP水平的影响。像以前一样,帕金突变
成纤维细胞由两个相同的患者相匹配的对照
两次治疗浓度为24小时10毫米。正打在
再次提高了细胞内的化合物,定义为第2阶段
至少在三个实验中, (至少)由至少3只SD ATP水平
2 SD第四。正面命中测试剂量反应曲线
( 0.01~100毫米) 。 S型剂量 - 反应正面命中
ATP含量的恢复效果进行了测试,在一个额外的曲线
两个帕金突变的患者和匹配控制成纤维细胞系。
第3阶段
选择排名靠前,然后从第2阶段为他们的进一步评估
4个个体的线粒体呼吸链复合物的影响
从四个帕金突变的患者在成纤维细胞和匹配控制
科目。成纤维细胞( 1.4 ? 107个细胞)治疗24小时
100nM的每种化合物的胰蛋白酶正在收获前
用于所有进一步分析。线粒体丰富的分数
个别线粒体呼吸链检测均做
如前面所述( Mortiboys ,等人,2008)。所有的数据表示
mg蛋白。蛋白测定采用Bradford法(皮尔斯)
按制造商的说明。
2 | 2013年脑: 2 13水平Mortiboys等。
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功能研究
药理抑制糖皮质激素受体
成纤维细胞接种到96孔板中(每孔5000个细胞) 。后
24 h后,细胞用1毫米RU486 4小时前添加要么
100nm的选择的化合物(见“结果”一节) 。细胞内ATP
水平测定24小时后如上述。
小干扰RNA糖皮质激素受体
击倒
小干扰RNA寡核苷酸,有针对性地
糖皮质激素受体基因( NR3C1 ) ,目标序列AAGTG的
CAAACCTGCTGTGTTT或争夺控制小干扰RNA
( Qiagen公司) 。小干扰RNA ( 10纳米) ( NC3C1目标或
加扰负)转染入成纤维细胞,用0.5mM的
脂质体? 2000年,根据制造商的指示。
糖皮质激素受体蛋白敲除效率
使用糖皮质激素受体ELISA ( Abnova公司)在48小时评估
转染后,按照制造商的说明。二十四
小时后转染细胞用100nm的选择
化合物; 24 h后测定细胞内ATP水平
所示。
总Akt和磷酸化量化
Akt的Ser473位点
Akt和磷酸化的Akt的Ser473位点(对) ELISA试剂盒(Invitrogen公司)进行
对成纤维细胞的细胞裂解液,按照制造商的说明
使用所提供的标准存在的蛋白量来计算。
所有数据都pAkt的比例为:总Akt ( Ser473位点) 。
药理抑制Akt通路
成纤维细胞接种到96孔板中(每孔5000个细胞) 。后
24 h后,细胞用1毫米LY294002或50NM triciribine
前15分钟加入100nM的选定化合物。细胞内ATP
水平测定24小时后如上述。
验证性实验
从胚胎15天小鼠制备小鼠皮层神经元
胚胎如前所述( Kasher等,2009) 。约
6 ?接种于96孔板的各孔中(以前104个神经元
涂有聚-L-赖氨酸)或2 ?接种到105个神经元
无论是ATP检测或收割每口井的24孔板
印迹分析或固定成像。经过5天的文化
神经元,我们使用ACCELL siRNA和ACCELL的siRNA转
媒体(按照制造商的指示, Dharmacon公司)
无论是争夺阴性对照小干扰RNA( ACCELL鼠标
的对照siRNA试剂盒, Dharmacon公司)或帕金小干扰RNA
(序列GUUUCCACUUGUAUUGUGU ) 。染后四十八小时
神经元与各种浓度的化合物剂量
24小时后,细胞内ATP检测
如上所述,或神经元免疫印迹收获。
进行免疫印迹如前所述( Mortiboys
等,2008) 。盖玻片,用4%多聚甲醛固定
随后的30分钟, PBS洗涤。细胞透
0.1% TritonTM X-100在室温下和10分钟,和阻止
用1%山羊血清1小时。细胞与初级抗体
(兔抗帕金; Abcam公司和小鼠抗TOM - 20 ; BD
Biosciences公司) ,随后PBS洗涤1:500一夜之间在4 ?C
用兔抗小鼠和山羊抗兔二和孵化
抗体在室温下1小时。细胞染色
赫司特,然后安装到玻片上使用的ProLong ?金
(Invitrogen公司) 。
如前面所述,细胞内ATP水平的测定
( Mortiboys等, 2008年) ,成纤维细胞从三个LRRK2G2019S
帕金森氏病和三个年龄sexmatched的突变患者
控制。选定的100nM的细胞用
测量前24小时的化合物。
统计分析
多个实验值表示为手段? SE (标准
错误)。统计学意义(纠正邦费罗尼)的评估
采用Student t检验进行数据正态分布,非参数
t-检验用于偏态分布的数据。的效果
多种因素进行了评估使用双因素方差分析测试。
结果
我们的筛选策略概要图中给出。 1。 2000年
化合物, 60提高了线粒体膜电位
在三四个帕金突变成纤维细胞由43 SD
实验,并通过42 SD第四。两种化合物引起
TMRM的荧光信号在随后的cellfree的增加
因此,检测和排除假阳性。进一步
9个化合物已被排除由于其毒性
(表1) 。全部49个建立了全剂量 - 反应曲线
剩余的化合物,其中还进一步评估
它们对总细胞内ATP水平。 49个化合物, 35
43帕金突变的成纤维细胞中的ATP水平增加
SD在至少三个实验42 SD在第四
(表1) 。使用这些进行了完整的剂量 - 反应曲线
前35个化合物。六化合物没有表现出类似药物,
S形剂量反应曲线,因此被排除在外,只剩
29种化合物。
然后测试这些的29个化合物中的每一个都为他们的救援
另外两个病人的成纤维细胞株的细胞内ATP水平的影响
成纤维细胞和两个控制线。 29种化合物, 15获救
细胞内ATP水平在所有四个帕金突变成纤维细胞由43 SD
行测试(表2) 。
的15种化合物,二,即ursocholanic酸和脱氢
乌索酸内酯(11,12) ( DUA ) ,被选定为进一步
考核。原因不调查余下的13个化合物
在此阶段,列于表2 ,并在更大的
详细地,在补充材料。 Ursocholanic酸和DUA
然后进一步评估复合物的活性,它们对
I-IV的呼吸链。 Ursocholanic酸显着
救出,并增加了活性复合物I - IV 200 -
500% (图2) 。 DUA治疗取得了非常相似的结果
(补充图1 ) 。
有趣的是, 7 15期2阳性点击类固醇或
与四个碳环形成的相关的化合物(甾体)
骨干网中的每一个特定的化合物,包括ursocholanic
酸和DUA (表2) 。因此,我们推测,他们
观察到的抢救效果通过激活介导的
糖皮质激素受体。为了进一步验证这一假说, parkinmutant
预处理细胞糖皮质激素受体拮抗剂
RU486 ,以确定是否糖皮质激素受体
在家族性PD脑2013年:第3页共13 | 3 Ursocholanic酸
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抑制可能会取消DUA和观察抢救效果
ATP含量ursocholanic酸。据预测, RU486完全
消除所有测试的化合物对细胞的抢救效果
ATP水平(图3A) 。为了进一步验证这些结果,我们使用了一个
不同的方法,即小分子干扰RNA介导的糖皮质激素
受体击倒与ursocholanic治疗前
酸或DUA 。糖皮质激素受体蛋白击倒证实
是75% ? 3.8%(是什么意思? SD )后48 h采用ELISA
转染(数据未示出) 。据预测,小分子干扰
RNA介导的糖皮质激素受体敲除取消
细胞内酸或100NM的ursocholanic的DUA抢救效果
ATP水平(图3B) 。
熊果酸和熊去氧胆酸最初不属于
屏蔽复方MICROSOURCE图书馆,但在化学上与
到酸和DUA (图4) ursocholanic 。熊果酸发挥其有益
影响对肌肉萎缩通过Akt的活化,即通过
增加的Akt磷酸化( Ser473的库克尔等, 2011) 。
同样,熊去氧胆酸发挥其保护作用
在SH-SY5Y细胞线粒体依赖性细胞程序性死亡
通过Akt的活化(骏和低, 2012年) 。
因此,我们评估的效果DUA和ursocholanic的酸
在Ser473的Akt磷酸化帕金突变成纤维细胞。
也有明显的增加在pAktSer473 : Akt蛋白比
DUA治疗后的400%和305 %,治疗后
帕金突变成纤维细胞与的ursocholanic酸( P50.05 )
在未经治疗帕金突变成纤维细胞的比率较
(图5A) 。有趣的是,这种变化只体现在parkinmutant
成纤维细胞,的pAktSer473 : Akt蛋白的比例控制在成纤维细胞
药物治疗后保持不变。接下来,我们的目的是确认
酸和DUA ursocholanic正在发挥他们的线粒体
抢救效果通过激活Akt通路
Akt的活化,而不是仅仅是与
抢救效果,我们最重要的化合物。据预测,预处理
要么Akt抑制剂LY29400 (磷脂酰肌醇3 - 激酶
抑制剂)或triciribine (一种选择性抑制剂,细胞磷酸化/
激活Akt )的抢救效果ursocholanic的取消
酸和DUA帕金突变成纤维细胞中的细胞内ATP水平
(图5B) 。
无论是DUA也不ursocholanic酸的是美国FDA许可的药物;小
他们在人类的生物利用度和安全信息。
与此相反,化学密切相关的胆汁酸熊去氧
酸作为原发性胆汁性肝硬化的治疗已在临床应用
430年。其临床药代动力学特点
( Ward等,1984)。的化学性质密切相关的熊果酸是一个
天然存在的化合物存在于许多植物。根据他们的
结构上的相似之处,我们推测熊果酸
熊去氧胆酸,可能有类似的线粒体救援
的效果DUA和ursocholanic酸。事实上,这两个熊果酸和
熊去氧胆酸归相似的细胞内ATP水平
为DUA和ursocholanic的酸(图6)观察到的效果。
影响在帕金缺陷的神经元
模型系统
接下来,我们评估的抢救效果ursocholanic酸和熊去氧
酸在神经细胞培养模型。小干扰
帕金RNA介导的敲除导致减少帕金
小鼠皮质神经元的80% ,显示西部蛋白水平
杂交和细胞内ATP水平下降了40% 。治疗
救出的10PM ursocholanic的酸或晚上10点的熊去氧胆酸
细胞内ATP的这些的帕金缺陷神经元的损失(图7) 。因此,
ursocholanic酸和熊去氧胆酸有抢救效果
不仅在帕金突变成纤维细胞的线粒体功能障碍,但
也在帕金缺陷的神经元。
在LRRK2G2019S突变的救援效果
病人组织
我们终于确定是否ursocholanic酸和化学
相关FDA许可的药物熊去氧胆酸还
线粒体救援效果,在其他形式的家庭
图1中的流程图显示了所使用的筛选策略的概述。每个屏幕的一部分被描绘为是的阳性数
击中被带到屏幕上的下一个阶段的化合物。
4 |脑2013年:第4页13 H. Mortiboys等。
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表1中的主屏幕上的正命中,结果从第1阶段和2的药物屏幕
药品名称第1阶段第2阶段
细胞
免费
毒性EC50
MMP
ATP
复苏
剂量
响应
曲线
EC50
ATP
醋酸鬼臼毒素3暧昧X X X
2,6 - Dimethoxyquinone 3 3 1 mM的X X X
银杏酸3 1.6MM 3 250NM
2’, β- dihydroxychalcone 3 3 200NM 3 250NM
加替沙星3 100nM的3 250NM
苯磺酸氨氯地平3 3 1毫米3 250NM
辛伐他汀3 3 1毫米X X X
对苯二酚3 3 1毫米X X X
7 Methoxychromone的3 100nM的X X X
普利普利3 12毫米3 150NM
头孢布烯3 3 1毫米3 250NM
头孢地尼3 25毫米3 350NM
3ALPHA -羟基-3 - deoxyangolensic的酸甲酯3 3 100nM的3 150nm的
二苯并噻吩3 600NM X X X
盐酸可乐定3 3 1毫米X X X
去甲丙咪嗪盐酸盐3 X X X X X
银杏内酯A 3 100nM的3 150NM
Sericetin 3 3 158nM 3 150NM
木栓3 3 1毫米3 150NM
7beta - 3β, diacetoxydeoxodeacetoxydeoxydihydrogedunin 3 240NM XXX
齐墩果酸乙酸酯3 X X X X X
Pristimerol双乙酸钠3 631毫米3 3 125奈米
Khellin 3 3 6毫米3 250NM
Khivorin 3 3 6毫米X X X
别嘌呤醇3 3 1毫米X X X
薄荷3 x 7毫米X X X
乙酰胆碱3 X 60毫米X X X
丙磺舒3 X 13毫米X X X
马来酸依那普利3 x 2毫米X X X
阿西维辛3 X 31MM X X X
麻黄碱盐酸盐(1R ,2S) 3暧昧3 XX
丙硫氧嘧啶3暧昧3 X X
丙酸氯倍他索3 10毫米3 3 1毫米
山道3 125奈米X X X
Ursocholanic酸3 3 1毫米3 350NM
马来酸Methylergonovine 3 3 3 XX暧昧
雄酮硫酸钠3 5MM 3 350NM
脱氢乌索酸内酯(11,12) (不再适用) 3 100毫米3 350NM
胆甾-5 - 烯-3 - 酮3 3 1毫米3 X X
氟米3 350NM 3 X X
盐酸哌唑嗪3 250NM 3 150NM
甲基盐霉素3 X X X X X
乙酸柏木酯3 X X X X X
N - benzyltropan -4 - 醇X 3 X X X X
甲氧萘丙醇X 3 X X X X
硫酸羟氯喹3 1.2MM 3 3 1毫米
11 Oxoursolic乙脂(不再适用) 3 0.1NM 3 150NM
泼尼松龙3 446毫米3 350NM
依布硒啉3 100nM的3 3 1毫
麻黄碱盐酸盐3 3 5毫米X X X
快照( S-亚硝基-N -乙酰青霉胺) 3 200NM XXX
3 - 氨基- β-蒎烯3 3 10毫米3 3 1毫
苯扎氯铵3 12.5nM 3 3 1毫米
松三糖3 3 1毫米3 3 1毫米
(续)
家族性帕金森脑2013 :第5页13 | 5 Ursocholanic酸
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帕金森氏病。因此,我们研究这些效果
化合物对细胞内ATP水平LRRK2G2019S突变病人
组织。从三个LRRK2G2019S突变成纤维细胞治疗
不同的病人携带这种突变与帕金森氏症
24小时的的酸ursocholanic或熊去氧胆酸为10nm
导致细胞内ATP水平的完整的救援(图8) ,类似
帕金突变的病人的组织中观察到的效果。因此,本
这些化合物的有益的效果是有限的,不会出现
到帕金相关的帕金森氏病。
讨论
线粒体功能障碍在两个零星的有力证据
家族性帕金森氏病建议针对线粒体
一个很有前途的战略帕金森氏疾病修饰疗法
病( Meissner等人, 2011; Schapira , 2012 ) 。我们此前
展示一个完整的救援中的线粒体功能障碍
帕金突变的患者组织使用谷胱甘肽前体
表1 (续)
药品名称第1阶段第2阶段
细胞
免费
毒性EC50
MMP
ATP
复苏
剂量
响应
曲线
EC50
ATP
3 Oxoursan ( 28-13 )内酯3 3 1 mM的X X X
布地奈德3 3 390nm的3 3 1毫米
醋酸泼尼松龙3 3 150NM 3 3 1毫米
Furegrelate钠3 3.9nM X X X
枸橼酸他莫昔芬3 1nm的3 3 1 mM的
6,7 - 二氯-3 - 羟基-2 - 喹喔啉羧酸3 3 3 XX不明确的
此表详细正面的主屏幕上点击,从第1阶段和第2阶段的药物屏幕各部分的结果。图3表示的化合物符合
必要的标准,并通过了这个特殊的阶段,X表示事实并非如此,因此没有采取任何进一步。 “无细胞”表明该化合物是否反应
与荧光染料四甲基罗丹明甲酯( TMRM )在无细胞的测定。 TOX “一栏上提供的信息可能各自的毒性
化合物。 ’ EC50值MMP ’表示的化合物中的线粒体膜电位的测定EC50浓度。 “ ATP恢复”表示如果化合物
帕金突变成纤维细胞中的ATP水平恢复也有效。的剂量响应曲线’表示的化合物是否显示了公知的特征在于剂量
响应曲线的形状。 ’ EC50值ATP提供信息有关的化合物的EC50细胞内ATP的测定。
表2顶,救出了线粒体膜电位和细胞内ATP水平在所有4名患者有15命中
药物的剂量响应曲线
药物名称复方的起源类固醇像
结构
补充意见
加替沙星合成X抗生素与葡萄糖稳态负面影响,并
体内神经功能
苯磺酸氨氯地平合成X约拮抗剂,担忧的副作用配置文件(包括
水肿,失眠,头晕,抑郁症)
3ALPHA -羟基-3- deoxyangolensic
酸甲酯
自然X无信息使用人或啮齿类动物
银杏内酯A天然X上一页研究已经给出了不一致的结果
银杏在神经退行性神经保护作用
疾病和相关模型系统
Pristimerol双乙酸钠半合成X无信息使用人或啮齿类动物
盐酸麻黄碱( 1R,2S)的天然X Sympatomimetic的胺,不容忍和药物相互作用
可能在帕金森氏症
Ursocholanic酸自然向前3
雄酮硫酸钠半合成类固醇,由于长期副作用的可能性排除
长期治疗
脱氢(11,12)乌索酸内酯天然推进
胆甾-5 - 烯-3 - 酮半合成胆固醇,排除由于副作用的可能性
长期治疗
硫酸羟氯喹合成X线粒体自噬的抑制作用
11 Oxoursolic酸醋酸自然3的化合物,我们无法取得更多
布地奈德半合成类固醇与高首过效应,排除可能性
有限的生物可用性
醋酸泼尼松龙半合成类固醇,由于副作用的可能性排除在长
长期治疗
枸橼酸他莫昔芬合成X可以引起认知障碍和其他严重的副作用
起源的化合物,类固醇样结构的存在为理由,不采取这些化合物多数提供了更多信息
前进。采取远期两种化合物化学相关的物质ursocholanic酸和脱氢(11,12)乌索酸内酯。其他信息
从进一步的分析中被排除的那些化合物中提供补充材料。
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L-2-氧代噻唑烷-4 - 羧酸( OTCA ) ,并且也是温和的部分
雷帕霉素治疗后救援对线粒体功能的影响
( Mortiboys等, 2008年,覃等人,2009) 。在这些基础上
’原则“数据证明,我们现在已经开展的第一个药物
在帕金森氏症患者组织和屏幕上发现了一组
化学相关的化合物的抢救效果显着
线粒体功能。我们的数据与以前保持一致
牛磺酸缀合物的一个防护作用的研究报告
熊去氧胆酸( TUDCA )对线粒体毒素
帕金缺陷的线虫(韦达等人,2005)。
近日, Akt蛋白介导的,局部的神经保护效果
TUDCA一直对MPTP诱导的多巴胺能细胞死亡
观察帕金森氏病的小鼠模型(卡斯特罗
卡尔达斯等, 2012) 。我们的数据有力地表明一类的效果
胆汁酸及其衍生物,如DUA , ursocholanic磺酸和
熊去氧胆酸与自然的五环三萜
图2救援100NM ursocholanic酸(UCA) 24小时治疗帕金突变成纤维细胞中线粒体的功能。
( A ) (B)的线粒体膜电位和细胞内ATP水平降低帕金突变在未经治疗的患者的成纤维细胞
比未经处理的对照组( P50.05 ) ,治疗与酸ursocholanic结果在线粒体膜正常化
潜力和ATP水平( P50.05 ) 。 (C)的线粒体膜电位和(D)增加处理后的细胞内ATP水平
浓度的酸24小时ursocholanic ,反映了S形剂量反应曲线。 ( E和F)的每一个单独的活
呼吸链酶增加通过控制和帕金突变成纤维细胞与ursocholanic酸处理。数据提交
校正的蛋白水平* P50.05 , P50.01 ** ,*** P50.001 。
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熊果酸。乌索酸的生物利用度,其剂量依赖性
增加小鼠脑组织中已经得到很好的特点
(Yin等,2012 ) 。两个熊果酸和一个有益的影响
熊去氧胆酸或牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)也已经被描述在不同的
在体外和体内模型系统的其他
神经退行性疾病,包括阿尔茨海默氏病,
亨廷顿氏病和中风(基恩等人, 2002;罗德里格斯
等,2003;拉马略等人,2008;威尔金森等人,2011年) 。
值得注意的是, 7分15救出线粒体的化合物
膜电位,细胞内ATP水平以及
图3糖皮质激素受体的抑制或击倒废除抢救效果ursocholanic酸(UCA)和DUA
帕金突变成纤维细胞。 ( A )与对照组相比,细胞内ATP水平降低帕金突变的患者成纤维细胞(黑网吧)
(白条) ,治疗与100nM的ursocholanic的酸或DUA 24小时后恢复至正常水平。这种救援的效果是完全
取消预处理4小时1毫米的RU486 (糖皮质激素受体拮抗剂) 。 ( B )在细胞内ATP水平降低
无论是争夺小干扰RNA (深灰色条)或糖皮质激素受体小帕金突变患者成纤维细胞转染
RNA干扰(黑网吧)与对照组相比,成纤维细胞转染与争夺小干扰RNA (白条)或糖皮质激素
受体的小分子干扰RNA (浅灰色吧) * P50.05 。 100NM ursocholanic酸或DUA完全抢救与治疗
这一缺陷在帕金突变成纤维细胞转染与争夺小干扰RNA(白色和深灰色的吧) ,但不是在帕金
突变体成纤维细胞转染与糖皮质激素受体的小分子干扰RNA治疗与ursocholanic酸和DUA (黑网吧)
与对照组相比,也转用糖皮质激素受体的小干扰RNA(浅灰色吧) 。 DMSO =二甲亚砜。
图4结构的两种化合物确定原药屏幕,即( A )脱氢(11,12)乌索酸内酯和
( C ) ursocholanic酸和两个另外的化合物的结构相似,即乌索酸( B )和(D)熊去氧胆酸。该
以红色突出显示的结构相似。标准化学格式显示的三维取向的结构表示在
组。若没有指定组甲基连接。氢只示出当它们影响的分子的三维取向。
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经药物等的剂量响应曲线具有类固醇结构。
Lim等。 (2012)独立报告具有神经保护作用
的化学性质密切相关的甾醇的生物合成中间体
羊毛甾醇。熊果酸和羊毛甾醇引起轻微的线粒体
解偶联是一个很有前途的战略已经提出
对疾病修改,帕金森氏病( Liobikas等,
2011豪等, 2012 ; Lim等, 2012) 。
抑制的线粒体抢救效果DUA ,并
ursocholanic酸预处理后与RU486是一致的
与以前的意见,对糖皮质激素受体介导的
乌索酸的生物活性或熊去氧胆酸(田中
牧野, 1992年Sharma等人, 2011) 。然而,全基因组
基因表达的研究没有发现任何相关的和连贯
帕金突变成纤维细胞与熊果酸治疗后的变化
酸或DUA (数据未示出) 。特别是,有没有影响
信使RNA水平的线粒体主监管等
,作为PGC1alpha (现在被称为PPARGC1A )或线粒体
解偶联蛋白。糖皮质激素的生物学功能
包括基因组和非基因组效应,包括
直接绑定到线粒体膜,从而导致
部分氧化磷酸化的解偶联(哈勒等人,
2008年)。
我们明白,我们的工作主要侧重于评估
帕金突变的帕金森氏病患者中的化合物的效果
组织。然而,铅化合物的有益效果, ursocholanic
酸和化学相关的持牌药物熊去氧
酸也显而易见在LRRK2G2019S突变
成纤维细胞。所有零星的10 %和30 %的家族
帕金森氏病是由于的LRRK2G2019S突变的
德系犹太人与帕金森氏症患者( Ozelius等,
2006年)。在其他人群中的患病率可能会更高
(勒萨热等,2006) 。线粒体的表型是一般
接受是正确的PARK2的,但需要额外的工作
确定救援线粒体功能是否会导致
神经功能障碍和细胞损失至少部分救援
突变体LRRK2G2019S的模型系统。如果这是要的情况下,
那么,我们的铅化合物或结构相关的药物可能已经
中的显着数量的患者具有有益的作用
帕金森氏病,即使它们的效果是有限的帕金
LRRK2G2019S突变只与帕金森氏症患者。
线粒体功能障碍的发病机制有牵连
吸毒者帕金森帕金森氏病
意外曝光后,复杂的I抑制剂MPTP
(安博苏莱曼等, 2006; Schapira 2008 )。随后,几
组报道独立复杂的I下降活动
帕金森氏病( Mizuno等人, 1989 ; Parker等人,1989 ;
schapira等人,1989)。现在人们普遍接受,线粒体
功能障碍和受损的形态,发挥了至关重要的作用
由于基因突变的早发性帕金森氏病的发病机理
在帕金( PARK2 ) , PINK1或DJ1 ( PARK7 ) ( Cookson和
Bandmann ,2010) 。线粒体功能障碍也已经
观察病人组织(见上文)或模型系统lateonset
帕金森氏病由于基因突变在LRRK2或α
突触核蛋白( SNCA ) (勒布等, 2010 ;欣德等人, 2013) 。 Akt的,
蛋白激酶具有多个目标的连续被激活
在两个站点的磷酸化。一直Akt信号故障
形容为“共同核心”相关神经元变性
在家族性和散发性两种帕金森氏症和细胞死亡
( Greene等人,2011年) 。 Akt磷酸化减少多巴胺
散发性帕金森氏病的神经元( Malagelada等,
2008蒂蒙斯等,2009) 。既增加了表达的α
突触核蛋白( SNCA )和SNCA基因突变导致降低Akt的
图5 Akt的抢救效果的ursocholanic酸和DUA
调解。 ( A )的比率pAktSer473蛋白水平Akt总
用ELISA法测定蛋白质水平。 pAktSer473水平
增加在帕金突变的患者细胞治疗后
都ursocholanic的酸(灰色)和DUA (黑网吧)
( *** P50.001 , * P50.05 ) 。 (B和C )细胞内ATP水平
控制成纤维细胞(白条)和帕金突变成纤维细胞
(黑网吧) 。预处理与磷脂酰肌醇
3 - 激酶( PI 3 - 激酶)抑制剂LY29400或triciribine
选择性地抑制细胞的Akt的磷酸化/活化,
废除救援效果两个ursocholanic的乳酸(B )和DUA
(C ) ( P50.05 * ) 。 DMSO =二甲亚砜。
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激活( Chung等,2011年) 。同样,LRRK2突变(
特别是G2019S ),以及帕金, PINK1和DJ1缺乏
造成下降的Akt磷酸化(杨等, 2005 ;伦
村田制作所等, 2011 ; Ohta等, 2011)等,2006;与此相反,
β-突触核蛋白的保护作用是介导的增加
Akt磷酸化和增加帕金表达正常化
Akt磷酸化减少MPTP处理小鼠(桥本
Yasuda等人,2011年)等人,2004;进一步的工作是需要确定
线粒体抢救效果和是否增加Akt的
Ser473的磷酸化处理后与ursocholanic酸
和DUA (我们帕金突变成纤维细胞模型观察)
也可以观察到在其他的形式和模型系统的帕金森氏
疾病。
熊去氧胆酸已经获准用于治疗
自1980年以来,原发性胆汁性肝硬化患者。它通常是
在剂量为10毫克/公斤患者体重每天使用
原发性胆汁性肝硬化,但Parry等。 (2010)也报道
“优秀”的安全性和耐受性的熊去氧胆酸
运动神经元疾病患者15毫克, 30毫克和50毫克/
每天每公斤。有一个显着的相关性之间血清和
CSF熊去氧胆酸的浓度。因此,有
也可能是很好的理由认为熊去氧胆酸
良好的耐受性帕金森氏病和穿越血脑
屏障。 FDA许可的药物,如熊去氧胆酸药物重新定位
酸是一种很有前途的战略,以节省时间和成本
但帕金森氏病的具体的,可靠的数据安全性,耐受
熊去氧胆酸和脑脊液渗透仍会
熊去氧胆酸可以是至关重要前
考虑到临床试验,以评估其公认的疾病修饰
在帕金森氏病的效果。
诱导干细胞是来自于多巴胺能神经元
已经被用来评估假定救援化合物
帕金森氏病的重要致病机制的影响
和其他条件( Cooper等人, 2012) 。然而,诱导
干细胞为基础的方法,虽然在许多方面令人兴奋的和
有前途的,也是昂贵的,而不是没有固有的问题。我们的
研究表明,分步进行的策略,涵盖
帕金森氏症患者的成纤维细胞中,但初始屏幕
图6救援24小时的治疗帕金突变成纤维细胞100NM ursocholanic酸细胞内ATP水平(UCA ) , DUA
( B ) ,熊果酸( UA , C)和熊去氧胆酸( UDCA ,D ) 。细胞内ATP水平显着降低治疗帕金突变
病人的成纤维细胞( * P50.05 ) ,但与任何这四个各自的药物( * P50.05 ** P50.01 )治疗后显着增加。
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事后确认的排名靠前的一个神经元系统
可能是一个成本更低和更可靠的策略。
以往的研究调查潜在的抢救效果
药理化合物在发病早期的模型系统
帕金森氏病都集中在一个假设驱动
方法测试个体的化合物,而不是评估一个
化合物库中一个假设的方法。维生素K(2)
作为一个线粒体的电子载体,救援线粒体
PINK1基因缺陷的果蝇( Vos等,2012 )的功能障碍。
然而,目前还不清楚是否抢救线粒体维生素K(2)
帕金缺乏功能障碍。二糖海藻糖
增加通过清除异常蛋白质
提高自噬。海藻糖治疗可改善头
病理学,但无法恢复的多巴胺能神经元的损失在
小鼠模型中过度表达与帕金森tauopathy
人类tau蛋白的突变与帕金删除(罗德里格斯
纳瓦罗等人, 2010)。辅酶Q10减少的脆弱性
诱导干细胞来源的, PINK1突变的神经细胞
最低的,但没有高浓度缬氨霉素和concamycin的
A ,雷帕霉素并未减少乳酸脱氢酶释放
后暴露于这些毒素。与此相反,雷帕霉素和
的LRRK2抑制剂GW5074线粒体降低了生产
PINK1突变的神经细胞的活性氧
暴露于缬氨霉素。然而,没有这些化合物
被评定为其基线线粒体的抢救效果
( DYS)毒素暴露前PINK1突变模型系统的功能
( Cooper等人,2012 ) 。 ,可能preceeded未来药物屏幕
通过在硅片屏幕,其可能产生的影响评估化合物
增强的生物活性的蛋白质,例如帕金
PINK1 ,而且在其他的蛋白质,例如与硫氧还蛋白
报告的抢救效果在帕金缺陷的果蝇(梅田
龟山等, 2007; Trempe等, 2013) 。其他治疗
办法包括绕过复杂的酶过度表达
我作为酿酒酵母酶Ndi1p的等活动
(维兰等人,2012 ) 。
致谢
我们要感谢所有的研究参与者。
资金
帕金森的英国(G -0715 G - 0901 )的财政支持
感谢。
Suppplementary材料
补充材料可在网上脑。
参考文献
阿布·苏莱曼下午, Muqit MM ,木净重。扩大线粒体的见解
在帕金森病的功能障碍。纳特冯神经科学2006 ;
7: 207-19 。
图7 Ursocholanic酸( UCA )和熊去氧胆酸
( UDCA )小干扰皮层神经元的抢救效果
RNA介导的帕金击倒。 ( A ) Western blot检测显示
帕金? 50 kDa和肌动蛋白带带? 40 kDa的争夺
小干扰RNA和帕金的小分子干扰RNA转染
皮层神经元。 ( B )帕金蛋白水平减少
80 %帕金小干扰RNA击倒皮质
神经元由西方墨点法( P50.001 *** )评估。
( C )在皮层神经元的细胞内ATP水平在9天中文化
无论是争夺小干扰RNA(白色转
条) ,或帕金小干扰RNA (黑网吧) 。存在这样一种
帕金小细胞内ATP水平降低了43%
干扰RNA转染的细胞, ( ** P50.01 ) ,这是获救
处理与10PM ursocholanic的酸或熊去氧
酸。 DMSO =二甲亚砜。
图8细胞内ATP水平降低成纤维细胞
三LRRK2G2019S突变的患者(黑网吧)相比,
对照组(白条) * P50.05 。有完全恢复
治疗后10nM的ursocholanic的ATP到正常水平
酸或10nM的熊去氧胆酸24小时。
DMSO =二甲亚砜。
Ursocholanic酸在家族性帕金森脑2013 :第11页, 13 | 11
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